童敏， 杨向军
 苏州大学附属第一医院

    目的 研究超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4（HCN4）改造的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）与心室肌细胞共培养，构建具有自律性的心脏生物起搏器模型的可行性；并研究MSC中过表达连接蛋白45（CX45）对以上生物起搏器模型自律性的影响。 
    方法1）体外分离培养新生大鼠的心室肌细胞，鉴定纯度及活力；并通过膜片钳方法记录心肌细胞的自发性动作电位。2）基因克隆的方法构建包含HCN4 基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4，并通过四质粒系统包装成慢病毒颗粒，转染大鼠的MSCs，构建成HCN4+MSCs；将仅转染有GFP 基因的慢病毒颗粒的MSCs 设为HCN4－MSCs。通过RT-PCR，以及荧光观察鉴定HCN4基因在MSCs 中的表达；电压钳记录阳性转染细胞的起搏电流If。3）将HCN4+MSCs 与乳鼠心室肌细胞共培养构建心脏生物起搏器模型，同时将HCN4－MSCs 与心肌细胞共培养设为“HCN4－MSCs 对照组”。为了监测生物起搏器的自律性，初步分析自律性变化的原因，计数心室肌细胞自发搏动频率、记录自发性动作电位；并通过免疫荧光标记等方法鉴定共培养的两类细胞间连接蛋白43（CX43）的表达；加入缝隙连接阻断剂甘珀酸验证缝隙连接在模型中的价值。 
    结果1) 该方案分离培养的新生大鼠心室肌细胞消化瞬时的活细胞率为80％；培养至第5 天时85％左右的心肌细胞都有自发性搏动，搏动频率80 次/min 左右；培养至第9 天后心肌细胞纯度开始大大降低；培养5 天心肌细胞的自发性动作电位阈电位为－60mV， 频率84±12 次/分，节律不规则。2) 通过酶切鉴定以及基因测序证实HCN4 基因成功构建到pCDH1-MCS1- EF1-copGFP 质粒中，形成包含目的基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4；通过穿梭质粒的介导成功将HCN4 基因包装成慢病毒载体lentiv-GFP/HCN4，real-time PCR 测定lentiv-GFP/HCN4 滴度为3×10TU/mL。通过慢病毒载体介导HCN4 基因转染MSCs，5 天后，荧光显微镜下观察转染阳性率约70%；RT-PCR证实HCN4＋MSCs 中有HCN4 mRNA 的表达；膜片钳记录到HCN4＋MSCs 上有时间和电压依赖性的超极化激活的内向电流，该电流的激活阈电压为-70mV，对低浓度CS＋敏感，符合If 的特征。至此说明，MSCs上已经成功表达有起搏离子通道HCN4。3) 将HCN4＋MSCs 与3d 心肌细胞共培养2－4d后，发现实验组心肌细胞的自发搏动频率明显快于“HCN4－MSCs 对照组”中的心肌细胞自发搏动频率。膜片钳结果显示心肌细胞的自发动作电位频率显著提高(129±11 次/分vs. 82±8 次/分，P<0.05，n=5）；动作电位频率变规则；动作电位最大舒张电位(MDP)绝对值降低（－66±6mV vs. －87±4mV，P<0.05）；而实验组与对照组的阈电位均为－60mV左右。免疫荧光标记证实共培养的两类细胞相接触部位的膜上有CX43 的表达；加入缝隙连接阻断剂甘珀酸后，观察实验组心肌细胞的自发搏动频率明显降低，而且变的不规则。综上，HCN4 基因改造的MSCs 与心室肌细胞共培养，成功构建成具有自律性的心脏生物起搏器模型；缝隙连接在生物起搏器模型中具有重要价值。 
    结论 HCN4 基因改造的MSCs 与心室肌细胞共培养，成功构建成具有自律性的心脏生物起搏器模型；MSCs细胞膜上CX45 的高表达，使得以上生物起搏器模型的自律性提高。